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淺談?dòng)绊憻晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的幾大因素

更新時(shí)間:2023-11-28      瀏覽次數(shù):1973

淺談?dòng)绊憻晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的幾大因素


 

首先什么是PCR呢?

PCR的全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(英文全稱:Polymerase Chain Reaction),是一種體外酶促合成特異DN的方法,也可以稱作無(wú)細(xì)胞分子克隆或DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。它不僅可用于基因分離,克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。


PCR分為定性PCR和定量PCR兩類(lèi):定性PCR只能通過(guò)終點(diǎn)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析,而不能進(jìn)行定量分析;定量PCR能通過(guò)加入的熒光分子信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)。相對(duì)來(lái)說(shuō),定量PCR的檢測(cè)靈敏度更高;特異性好,準(zhǔn)確性高;線性關(guān)系好,范圍寬;操作更簡(jiǎn)單安全。

 

PCR實(shí)驗(yàn)的基本因素及過(guò)程反應(yīng)成分:引物,酶,模板DNA,dNTP,Mg2+鎂離子濃度 。


反應(yīng)過(guò)程:1、模板變性;2、引物退火;3、新鏈延伸。

這三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán),每一個(gè)循環(huán)度產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)度模板,經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后,目的DNA以2n的形式增加。

 

除了以上五個(gè)主要因素外,還有實(shí)驗(yàn)耗材因素和溫度因素:

1:首先PCR實(shí)驗(yàn)試劑的總體積一般為25ul~100ul,因此所選用的耗材必須是吸附低的;

2:PCR實(shí)驗(yàn)需要高溫解鏈,低溫合鏈,中溫延伸,因此要求所選用的耗材需要有很好的熱傳導(dǎo)率;

3:PCR實(shí)驗(yàn)需要不斷的循環(huán)升溫,降溫,這就要求所選用的耗材必須有良好的氣密性;

4:PCR實(shí)驗(yàn)還需要循壞的收集數(shù)據(jù),需要選用的耗材有良好的均一性。

5:另外根據(jù)實(shí)驗(yàn)使用儀器的不同,熒光定量實(shí)驗(yàn)中熒光讀取方式不同,對(duì)耗材還有以下不同的要求:

  a:采用頂部熒光照射并于頂部回收熒光的儀器,要求管蓋或者封板膜必須是光學(xué)透光的性能,同時(shí)管壁最好選擇不透光材質(zhì);

  b:采用側(cè)方熒光照射并于頂部回收熒光的儀器,要求管蓋或者封板膜必須是光學(xué)透光性,同時(shí)管壁也要是高透光的透明材質(zhì);

  c:采用側(cè)方熒光照射并于側(cè)方回收熒光的儀器,要求管蓋或者封板膜最好選用不透光材質(zhì),同時(shí)管壁選擇高透光的透明材質(zhì)。

 

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